細菌の天敵ウイルス「バクテリオbcゲーム リチャージ」を試験管内で 改変する方法および生物学的に封じ込める方法を開発 薬剤耐性細菌感染症治療への応用
【本研究のポイント】
・様々なバクテリオbcゲーム リチャージのゲノムを試験管内で自由に改変・構築して起動する技術を開発しました。
・化学合成されたDNAからゲノムを構築して、親としてbcゲーム リチャージを持たない人工bcゲーム リチャージを創出しました。
・bcゲーム リチャージの生物学的封じ込め1)法を開発しました。
・致死性敗血症マウスに対して、生物学的封じ込めbcゲーム リチャージは明らかな治療効果を示しました。
【研究概要】
抗菌薬の効かない細菌感染症の蔓延に伴い、細菌に感染する天敵ウイルスである「バクテリオbcゲーム リチャージ」（bcゲーム リチャージ）を使った治療法「bcゲーム リチャージセラピー」が注目を集めています。自然環境などに存在する天然（野生型）bcゲーム リチャージに加え、近年では遺伝子組換えなどを施した改変型bcゲーム リチャージを使うアプローチも報告されています。機能性を高めた改変型bcゲーム リチャージは、より効果的なbcゲーム リチャージセラピーを可能にするものと期待されています。しかし、従来の手法によって改変できるbcゲーム リチャージは極めて限定的でした。また、改変型bcゲーム リチャージを封じ込める（環境中に拡散させない）ための技術開発についての報告はありませんでした。
岐阜大学医学系研究科bcゲーム リチャージバイオロジクス研究講座の満仲翔一研究員（筆頭著者）、安藤弘樹 特任准教授（責任著者）らのグループは、bcゲーム リチャージゲノムを試験管内で改変・構築して起動できるbcゲーム リチャージ合成改変技術を開発しました。これを使って実際に多くのbcゲーム リチャージを起動させ、また、データベース上の配列データからDNAを化学合成し、試験管内で構築し、人工bcゲーム リチャージを起動させることにも成功しました。これらの結果は、本技術の汎用性が高いことを示しています。さらに、一回しか感染・殺菌しない生物学的封じ込めbcゲーム リチャージの作製方法を開発しました。本技術を改変型bcゲーム リチャージに応用することで、より効果的でより安全な改変型bcゲーム リチャージセラピーの実現が期待されます。
本研究成果は、日本時間2022年11月21日にProceedings of the National Academy of Sciences（PNAS）誌のオンbcゲーム リチャージン版で発表されました。
【研究背景】
バクテリオbcゲーム リチャージ（bcゲーム リチャージ）は細菌に感染するウイルスで、宿主細菌への吸着、細菌内での増殖、溶菌を介した子bcゲーム リチャージの外環境への放出、新たな宿主細菌への感染を繰り返します。この生活環を利用した細菌感染症治療法は「bcゲーム リチャージセラピー」と呼ばれ、抗菌薬が効きにくい、もしくは全く効かない多剤耐性細菌感染症に対する新たな治療法として注目されています。しかしながら、bcゲーム リチャージ（セラピー）にもいくつかの弱点があります。例えば、宿主域2)の狭さです。同じ細菌種でも株の違いによって感染できないことが多々あります。また、宿主域の狭さはbcゲーム リチャージ耐性菌の出現のしやすさにも繋がります。したがって、bcゲーム リチャージセラピーには異なる宿主域を持つ複数のbcゲーム リチャージを混合したbcゲーム リチャージカクテルを用いるのが一般的です。カクテルを調製する際もbcゲーム リチャージの種類によってはお互いの効果を打ち消し合ってしまうことがあり、bcゲーム リチャージの相性や安定性を考慮する必要があります。
これらの弱点については、bcゲーム リチャージを改変することで克服できる可能性があります。例えば、一種類（単一）のbcゲーム リチャージを用意して、これを改変することで異なる宿主域を与えられるという報告があります。これらの単一でありながら宿主域だけが異なるbcゲーム リチャージをカクテルとして用いることで、効果的な殺菌とbcゲーム リチャージ耐性菌の抑制が可能であることが報告されています。また、抗菌遺伝子などをbcゲーム リチャージに搭載させることによって、殺菌効果を向上させられることも分かっています。改変型bcゲーム リチャージを使えばbcゲーム リチャージセラピーのさらなる治療効果の向上が期待できますが、これを実現するには二つの大きなハードルを越える必要があります。一つは、bcゲーム リチャージを改変することが極めて難しいことです。改変できるのは一部のモデルbcゲーム リチャージもしくは特殊な改変系が確立されているごく少数のbcゲーム リチャージに限定されていました。近年ではbcゲーム リチャージゲノムを構築し、宿主細菌に導入することで改変型bcゲーム リチャージを創出する手法がいくつか報告されましたが、やはり対象は限定され、汎用性が実証されていませんでした。もう一つは、改変型bcゲーム リチャージが遺伝子組換え生物3)に該当するため、環境中への拡散を防ぐ必要があることです。私たちの知る限りでは、今までにそのような技術開発に関する報告はありませんでした。
私たちは、効率的かつ迅速な汎用性bcゲーム リチャージ合成改変技術を開発し、またこれを応用して改変型bcゲーム リチャージを生物学的に封じ込めることで、二つのハードルを乗り越え、より効果的でより安全な改変型bcゲーム リチャージセラピーを社会実装できると考えました。
【研究成果】
PCR産物からbcゲーム リチャージゲノムを試験管内で構築し、エレクトロポレーション法4)によって宿主細菌に導入することで、bcゲーム リチャージを起動しました（図１）。様々なグラム陰性細菌に感染する複数のbcゲーム リチャージ、特殊な膜構造を有する抗酸菌に感染する複数のbcゲーム リチャージ及びこれらの改変bcゲーム リチャージの起動に成功しました。この結果は、私たちのプラットフォーム技術の汎用性の高さを示すものです。
本手法を用いて、配列データを基に化学合成されたDNAから抗酸菌bcゲーム リチャージを創出することに成功しました。このbcゲーム リチャージのゲノムサイズは52,797 bpで、私たちが知る限りではこれまでに化学合成されたDNAから創出されたウイルスとしては最長サイズになります。また、創出したbcゲーム リチャージのゲノムは1塩基の違いもなくデザイン通りでした。この結果は、コンピューターでデザインした完全なテーラーメイドbcゲーム リチャージの創出が可能であることを示しています。
大腸菌に感染するbcゲーム リチャージのゲノムを試験管内で構築し、これを大腸菌の粗抽出液から調製された無細胞転写翻訳系に加えることで機能的なbcゲーム リチャージを創出することに成功しました。この結果は、bcゲーム リチャージゲノムの構築から起動までの全工程を、生物を介さずに試験管内だけで行えることを示しています。本研究の一部はトヨタ紡織株式会社との共同研究として実施されました。
bcゲーム リチャージ合成改変技術を応用して、二つの生物学的封じ込め法を開発しました。一つはbcゲーム リチャージゲノムの代わりにプラスミドDNA5)をbcゲーム リチャージの頭部に詰め込むというものです。このbcゲーム リチャージは、標的細菌に感染すると宿主細菌にプラスミドDNAを注入し、機能を発現します。bcゲーム リチャージゲノムを持たないためbcゲーム リチャージが増殖することはありません。もう一つは、bcゲーム リチャージゲノムからビリオン遺伝子6)を除くというものです。このbcゲーム リチャージは見た目も感染性も殺菌性ももとのbcゲーム リチャージと変わりませんが、子bcゲーム リチャージを作ることができません（図２）。一回限りの感染と殺菌を可能にする非増殖性の生物学的封じ込めbcゲーム リチャージと言えます。非増殖性bcゲーム リチャージは欠失したビリオン遺伝子を発現する宿主細菌を介して増殖させることができるのも特徴です。
致死性の敗血症7)に罹ったマウスに対して非増殖性bcゲーム リチャージを用いたbcゲーム リチャージセラピーを実施した結果、明らかな治療効果を示しました。また、治療したマウス体内から増殖可能なbcゲーム リチャージは見つかりませんでした。この結果は、非増殖性bcゲーム リチャージがbcゲーム リチャージセラピーに利用可能であり、100%の封じ込めに成功したことを示すものです。
【今後の展開】
私たちのbcゲーム リチャージ合成改変技術は、様々なbcゲーム リチャージ種に適用できるものです。より有用なbcゲーム リチャージを創り出し、必要に応じて生物学的封じ込めを施すことで、より効果的でより安全な改変型bcゲーム リチャージセラピーが実現できると考えています。天然bcゲーム リチャージを用いるbcゲーム リチャージセラピーや抗菌薬との併用療法も視野に入れ、bcゲーム リチャージセラピーの一日も早い実現に向かって邁進します。
【論文情報】
雑誌名：Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)
論文タイトル：Synthetic engineering and biological containment of bacteriophages
著者：Shoichi Mitsunaka, Kohei Yamazaki, Ajeng K. Pramono, Megumi Ikeuchi, Tomoe Kitao, Naoya Ohara, Tomoko Kubori, Hiroki Nagai, Hiroki Ando
DOI:10.1073/pnas.2206739119
【用語解説】
1) 生物学的封じ込め : 遺伝子組換え生物が環境中に放出されても自然界で生存できないような遺伝的性質をあらかじめ与えておく方策。
2) 宿主域 : 感染できる宿主の種類の幅。“宿主域が狭い”は感染できる宿主の種類が少ないという意味。
3) 遺伝子組換え生物 : 遺伝子工学の技術を用いて遺伝子を操作された生物。
4)エレクトロポレーション法 : 短パルスの電流を利用して、細菌や細胞にDNAやRNAなどを導入する方法。
5)プラスミドDNA : 細菌や酵母の細胞内に存在し、染色体DNAとは独立して複製される小さな環状のDNA分子。
6) ビリオン遺伝子 : bcゲーム リチャージゲノム上に存在しており、bcゲーム リチャージを形成するためのタンパク質をコードする遺伝子。
7)敗血症 : 細菌、ウイルス、真菌などの感染症に対する生体反応が制御不能に陥ることで、生命を脅かす臓器機能障害が生じる症状。感染症がきっかけで起きる、二次的な症状。
【研究支援】
本研究は科学研究費助成事業(19K16636、15K21770)及びアステラス製薬株式会社の支援を受けて行われました。
【研究者プロフィール】
筆頭著者・満仲 翔一（みつなか しょういち）
岐阜大学医学系研究科bcゲーム リチャージバイオロジクス研究講座・研究員
2017年に立教大学で学位取得（博士（理学）、腸管出血性大腸菌のプロbcゲーム リチャージ内に存在するsRNAに関する研究）。学位取得後、岐阜大学医学系研究科病原体制御学分野に着任。2020年より現職。専門は分子生物学、合成生物学。
責任著者・安藤 弘樹（あんどう ひろき）
岐阜大学医学系研究科bcゲーム リチャージバイオロジクス研究講座・特任准教授
アステラス製薬株式会社・創薬アクセレレーター・Venture Unit Engineered Phage Therapy・Principal Investigator
2007年に大阪大学で学位取得（博士（医学）、腸管出血性大腸菌のIII型分泌装置に関する研究）。学位取得後、国立国際医療研究センター、マサチューセッツ工科大学を経て、2017年に岐阜大学医学系研究科病原体制御学分野に着任。2020年より現職。専門は細菌学、合成生物学。
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